实时荧光定量PCR的定量原理

实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 是一种用于实时扩增和检测特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物学技术。该方法利用荧光染料或探针，当与扩增的 DNA 或 RNA 分子结合时会发出信号，从而可以对目标序列进行量化。RT-qPCR 通常用于基因表达分析、病毒载量定量和基因突变检测等应用。

 

实时荧光定量PCR是利用荧光信号的变化，实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

 

1．扩增曲线

 

在实时荧光定量PCR进程中，通过荧光定量PCR仪，在PCR每个循环进行一次荧光信号的收集，以荧光强度为纵轴，循环次数为横轴，所得到的曲线称为PCR的扩增曲线。

 

2．荧光阈值

 

实时荧光定量PCR的前面十多个循环，荧光强度变化不大，荧光强度的平均值可称为基线值，在基线值的基础上，增加一定数量后得到一荧光值，这一点后，随着循环次数的增加，荧光强度明显增强，因此称该值为荧光阈值。一般取PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。

 

3．Ct值与标准曲线

 

Ct值是指PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。实验发现，Ct值与反应管内的模板数密切相关，起始拷贝数越多，Ct值越小。